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Validación del método de análisis de Diltiazem
tabletas 60 mg por espectrofotometría UV-VIS.
Estudio de los perfiles de disolución.
Validation of the analysis method of Diltiazem
tablets 60 mg by UV-VIS spectrophotometry. Study
of dissolution profiles.
Resumen
El Diltiazem, benzotiazepina antagonista de los canales del calcio, se emplea para el tratamiento de la hipertensión y la obstruc-
ción parcial de las arterias coronarias, conocida como angina de pecho. En el presente trabajo se realizó el estudio comparativo
de los parámetros de calidad y de los perles de disolución de las tabletas 60 mg comercializadas en Ecuador, frente al Incoril de
los laboratorios Bagó. El método de cuanticación del Diltiazem se validó por espectrofotometría UV-VIS. La validación permitió
comprobar que el método era especíco, sensible y lineal en una concentración de 60 mg con un coeciente de correlación r2 =
0,990, éste además fue preciso, exacto y reproducible y de conformidad para el análisis del producto.
Para los tres lotes estudiados no se presentaron diferencias signicativas en los parámetros sicoquímicos evaluados. Los perles
de disolución permitieron evidenciar marcadas diferencias en cuanto a la liberación del principio activo en el tiempo máximo de la
toma de muestra que fue de 180 min. De los tres lotes genéricos, solo uno cumplió con los factores f1 y f2 de diferencia y similitud
y presentó un mejor comportamiento en la velocidad de disolución y el porcentaje de eciencia.
Palabras clave: Parámetros de calidad; Perles de disolución; Validación.
Abstract
Diltiazem, a calcium channel bloking benzothiazepine, is used to treatment of hypertension and partial obstruction of the coronary
arteries, known as angina pectoris. In the present work, a comparative study of the quality parameters and dissolution proles of the
60 mg tablets marketed in Ecuador against Incoril from Bagó laboratories was carried out.. The quantication method Diltiazem
was validated by UV-VIS spectrophotometry. The validation made it to verify that the method was specic, sensitive and linear in a
concentration of 60 mg with a correlation coefcient of r2 = 0.990. It was also precise, accurate and reproducible and in accordance
with the analysis of the product. For the three batches studied there were no signicant differences in the physicochemical parameters
evaluated. The dissolution proles showed marked differences in the release of the active ingredient in the maximum time of the
sampling, which was 180 min. Of the three generic batches, only one complied with the factors f1 and f2 of difference and similarity
and presented a better behavior in the dissolution rate and the efciency percentage.
Keywords: Dissolution proles; Quality parameters; Validation.
Recibido: 27 de febrero de 2020
Aceptado: 19 de junio de 2020
Pilar, Soledispa-Cañarte
1
; Denisse, Caguana-Baquerizo
2
;
Viviana, García-Mir
3
; Migdalia, Miranda-Martínez
4*
1
Máster en Química Farmacéutica; Docente-Investigador. Universidad de Guayaquil, Ecuador; pilar.soledispac@ug.edu.ec; https://orcid.
org/0000-0002-5872-7830
2
Máster en Química Farmacéutica; Docente-Investigador. Universidad de Guayaquil, Ecuador; denisse.caguanab@ug.edu.ec; https://
orcid.org/0000-0002-4477-7749
3
PhD en Ciencias Farmacéuticas; Docente-Investigador. Universidad Técnica de Machala (UTMACH), Ecuador; vgarcia@utmachala.edu.
ec; https://orcid.org/0000-0002-5288-4771
4
PhD en Ciencias Químicas; Docente-Investigador. Escuela Superior Politécnica del Litoral, ESPOL; mgmiran@espol.edu.ec; https://
orcid.org/0000-0002-6728-1818
*Autor para correspondencia: mgmiran@espol.edu.ec
Revista Ciencia UNEMI
Vol. 13, N° 34, Septiembre-Diciembre 2020, pp. 34 - 46
ISSN 1390-4272 Impreso
ISSN 2528-7737 Electrónico
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Soledispa et al. Validación del método de análisis de Diltiazem tabletas 60 mg
I. INTRODUCCIÓN
La hipertensión arterial clasica como uno de
los principales factores de riesgo cardiovascular en
el mundo, y en particular, en los países con ingresos
bajos y medios, donde los índices son abrumadores.
En opinión de la Organización Mundial de la Salud
(OMS, 2013), esta patología constituye un obstáculo
para el buen estado de salud de esas poblaciones.
De acuerdo con estudios de este organismo
internacional, de cada 100 mil ecuatorianos,
1,373 padecen esta afección, en tanto Freire et al.
(2012), reere que una investigación realizada por
el Ministerio de Salud Pública (MSP) y el Instituto
Nacional de Estadísticas y Censos (INEC), reveló
que más de la tercera parte de las personas mayores
de 10 años (3 millones 187, 665) son prehipertensos
y 717, 529 ciudadanos entre 10 y 59 años padecen
hipertensión arterial.
Para el tratamiento de esta patología, uno
de los medicamentos utilizados es el diltiazem,
el cual está incluido en el Cuadro Nacional de
Medicamentos Básicos y Registro Terapéutico
del Ecuador (Torres et al, 2007). Este fármaco
se ha probado preclínicamente y ha demostrado
un efecto ansiolítico en ratones (Yoshizawa et al.,
2010). Clínicamente se emplea, en urgencias, en la
brilación auricular (Ross et al., 2016; Ward et al.,
2019) y solo o en combinación con el enalapril, para
el tratamiento de la hipertensión (Cushman et al.,
1998).
Otros usos que se le han dado a este fármaco son
como tópico en el tratamiento de suras anales y en
el postoperatorio de hemorroides (Rodríguez-Wong
et al., 2016 a y b; Ivanova et al., 2018).
El incremento de los precios de los medicamentos
innovadores afecta los presupuestos de los sistemas
de salud pública y privada de los países en vías de
desarrollo. Ecuador ha estimulado la producción
e importación de medicamentos genéricos, con el
propósito de limitar el gasto farmacéutico y poder
cumplir con su deber de garantizar la salud de la
población. En la oferta del mercado farmacéutico
a nivel global, se encuentran medicamentos
innovadores y genéricos, éstos últimos tienen
una presencia cada vez mayor por su bajo costo e
intercambiabilidad (Ortiz-Prado et al., 2014).
Sin embargo, vale apuntar que la introducción
de medicamentos genéricos ha revelado problemas
de calidad, por ejemplo, medicamentos con bajas
concentraciones o pobres disoluciones, que pueden
afectar la efectividad del tratamiento. No obstante,
dentro del marco legal se respalda el que cumplan
con los análisis de calidad post registro.
Uno de los principales objetivos de las
agencias regulatorias es asegurar la calidad de los
medicamentos durante todo su ciclo de vida. La
calidad se evalúa mediante estudios de laboratorio
tales como: identicación, potencia, pureza,
disolución, estabilidad del principio activo y la
intercambiabilidad entre medicamentos. Con estos
estudios se asegura que sean bioequivalentes con el
medicamento que ha demostrado ser ecaz y seguro
en los estudios clínicos, aceptados por las Agencias
Regulatorias (Huayanay-Falconí, 2012; Ortiz-Prado
et al., 2014).
De acuerdo con la Guía de la Food and Drug
Administration (FDA, 2019 a y b), es preciso realizar
estudios de bioequivalencia in vitro, constituidos
por estudios comparativos de perles de disolución,
para determinar la cantidad o porcentaje del
principio activo disuelto en función del tiempo, bajo
condiciones controladas y validadas (Segura, 2017).
En consecuencia, los estudios comparativos
de Disolución in vitro resultan útiles, dado que la
disolución propiamente es un paso limitante de
la absorción del medicamento (Ponce D´León y
Jaramillo, 2004; Polli et al., 2008; Baena y Ponce de
León, 2008, Saavedra et al., 2011; Jung et al, 2012).
Como objetivo de este trabajo se propone: Validar
el método de cuanticación de Diltiazem en tabletas
de 60 mg genérica por espectrofotometría UV-VIS
para la determinación de la bioequivalencia con el
medicamento innovador a través de la comparación
de sus perles de disolución y los parámetros de
control de calidad.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Selección de los productos
Se emplearon tres lotes de tabletas de diltiazem
60 mg del laboratorio que comercializa en el
Ecuador que se adquirieron en las farmacias
distribuidoras de la Ciudad de Guayaquil, así como
un lote de Incoril (medicamento innovador), todos
de diferentes fechas de elaboración y dentro del
período de vida útil. Al Incoril se le asignó la letra A
y a los tres lotes del diltiazem genérico las letras B, C
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Volumen 13, Número 34, Septiembre-Diciembre 2020, pp. 34 - 46
y D, respectivamente.
Control de calidad
Para el establecimiento de los parámetros de
calidad se siguieron los métodos descritos en la
USP39/NF34 (2016), previa validación de algunos
parámetros. Las comparaciones se realizaron frente
a un estándar de Diltiazem Clorhidrato (USP). En
los ensayos se empleó un espectrofotómetro UV/VIS
marca Shimadzu modelo UV 1700.
La evaluación se realizó a los cuatros lotes (A, B, C
y D). Las propiedades físico químicas determinadas
fueron: dimensiones (n=50, vernier), peso promedio
(n=10, balanza analítica Mettler Toledo), dureza
(n=20, durómetro DR SCHELEUNIGER), friabilidad
(n=6, friabulómetro VANKEL RFQFR-251) y
desintegración (n=6, desintegrador VANKEL VK-7).
Validación del método de análisis por
espectrofotometría UV, para cuantificar
Diltiazem, en tabletas Diltiazem 60 mg,
Se tuvieron en cuenta lo informado por (Pérez-
Navarro et al., 2014 y Pérez y Rojas 2015)
Las determinaciones fueron realizadas frente
a patrones secundarios de Diltiazem Clorhidrato
previamente valorados contra patrones primarios
y almacenados bajo condiciones de humedad y
temperatura que aseguran su estabilidad (USP39/
NF34 (2016).
Linealidad- Se construyeron curvas de calibración
de absorbancia a 237 nm (Y) vs concentración del
analito expresada en % (X), determinando los
coecientes de correlación (R) y determinación
(R2). El coeciente de variación (CV) de los factores
de respuesta (f) (< 5%) se calculó mediante la
relación de la respuesta analítica y la cantidad
del analito. Igualmente, se evaluó la signicación
estadística de la pendiente (p<0,05) a través del
análisis de varianza (ANOVA I). La proporcionalidad
del método se analizó a través de la prueba t student
donde t experimental debe ser menor que t tabulada.
En los análisis se trabajó con el programa estadístico
Statgraphics Centurión versión 18 y con un nivel de
signicación α=0.05.
Intervalo de trabajo. – Se consideraron 5
concentraciones en el rango de 80%- 120% para
tabletas de Diltiazem 60 mg. Cada determinación se
realizó por triplicado.
Exactitud. - Se utilizó un diseño empleando 3
niveles de concentraciones (bajo, medio y alto), cada
uno por triplicado. Los resultados fueron analizados
estadísticamente y se calcularon el porcentaje de
recobro R y el coeciente de variación.
% Recobro = concentración medida /
concentración añadida x 100
Precisión. – Se tuvo en cuenta los resultados de
repetibilidad y precisión intermedia
Precisión intermedia. – Se llevó a cabo con un
nivel de concentración de la muestra equivalente
al 100%, los análisis se repitieron cinco veces y se
emplearon tres analistas para realizarlos en tres
diferentes días. La aplicación de la prueba ANOVA
permitió establecer las diferencias estadísticamente
signicativas entre las medias alcanzadas. Previo
se vericó el cumplimiento de homocedistidad y
la distribución normal, mediante las pruebas de
Levene y Shapiro Wilk respectivamente. Ambas
determinaciones deben dar valores de signicación
p>005. Como criterio se exige que el coeciente de
variación (CV) sea menor del 2%.
Repetibilidad. - Para estos parámetros se
realizaron los ensayos en 5 días con intervalos de 48
horas cada análisis y tres concentraciones 90, 100
y 110%. Se realizaron 5 repeticiones entre las horas
del día.
A través de una curva de recuperación, se
realizó el análisis estadístico de la relación entre
las concentraciones medidas y añadidas. No deben
existir diferencias signicativas entre el valor del
recobrado medio y el 100%, además el coeciente
de variación debe ser ≤2%, para considerar que el
método es exacto.
Especicidad - se evaluó por triplicado
muestras independientes de tres formulaciones:
una desarrollada sin el principio activo (placebo),
otra de tabletas de diltiazem y una con el estándar
de referencia (SR). Se aplicó el método analítico
en las mismas condiciones de trabajo. A través de
la comparación entre las respuestas obtenidas se
determinó la posible interferencia de las sustancias
auxiliares.
Criterio de aceptación: Ninguno de los
componentes de la formulación debe dar respuesta
cuanticable como interferencia en el método en
estudio. El método debe ser especíco frente a los
excipientes, es decir, no deben aparecer señales
37
Soledispa et al. Validación del método de análisis de Diltiazem tabletas 60 mg
analíticas para el placebo a la longitud de onda (237
nm) de interés analítico para el diltiazem clorhidrato.
Preparación de los estándares secundarios de la
curva.
La curva de calibración se realizó con el estándar
secundario de Diltiazem Clorhidrato (0040073),
previamente valorado contra el estándar USP, el
cual se elaboró a tres concentraciones diferentes:
Concentración 1: 0.004 mg/ml. Pesar
exactamente 20 mg de Diltiazem transferir a un
matraz de 100 ml, disolver y llevar a volumen con
agua, de esta solución se pipetea 1 ml y se lleva a
volumen a un matraz de 50 ml.
Concentración 2: 0.005 mg/ml. Pesar
exactamente 25 mg de Diltiazem transferir a un
matraz de 100 ml, disolver y llevar a volumen con
agua, de esta solución se pipetea 1 ml y se lleva a
volumen a un matraz de 50 ml.
Concentración 3: 0.006 mg/ml. Pesar
exactamente 30 mg de Diltiazem transera a un
matraz de 100 ml disuelva y lleve a volumen con
agua, de esta solución pipetee 1 mL y lleve a volumen
a un matraz de 50 ml.
Se realizaron tres curvas de calibración, cada una
con 3 concentraciones. Las cuales se realizaron en
3 días consecutivos cada una y las absorbancias se
midieron en un espectrofotómetro UV 1700 a una
longitud de onda de 237 nm. Al nal, cuando se
obtuvieron los resultados, se seleccionó una de las
tres, la que tuviera un r2, más cercano a 1.
Valoración del Diltiazem.
Diltiazem 60 mg Tabletas. A partir de una tableta
triturada de peso aproximado 240 mg, se pesaron
100 mg que contenían aproximadamente 25 mg de
Diltiazem y se transrieron a un matraz volumétrico
de 100 ml con unos 70 ml de agua, se disolvió la
muestra agitando y se enrasó con agua, se pipeteó 1
ml a un matraz de 50 ml y se enrasó a volumen nal
con agua.
Perles de disolución con el Aparato 2 USP
A partir de los medicamentos en estudio (3 lotes
de diltiazem tabletas liberación inmediata y un lote
de Incoril innovador), se determinaron los perles
de disolución de acuerdo con el ensayo 711 de la USP
39 (USP NF, 2016), empleando un equipo Disolutor
marca Sotax tipo AT 7smart, de 7 vasos.
Para el desarrollo de este estudio se utilizó 900
ml de los diferentes buffers los cuales corresponden
a una solución de Ácido Clorhídrico 0.1N a pH 1.2, o
jugo gástrico simulado, solución amortiguadora de
Acetato pH 4.5, y solución de Mono fosfato Básico
de Sodio pH 6.8, o jugo intestinal simulado, con
aparato 2 o de paletas (USP NF, 2016).
El ensayo se realizó para cada medio y para
cada lote de forma independiente. Los medios se
desgasicaron previamente con vacío, y se trabajó
a una temperatura de 37 ± 0.5 °C. Las paletas
se sumergieron en los medios de disolución y se
accionaron a 75 rpm. Inmediatamente después se
colocó una tableta en cada vaso (6 vasos), dejando
en vaso 7 como blanco.
Una vez comenzado el experimento se toman
muestras de 10 mL a los 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120
y 180 min, reponiendo el volumen en cada ocasión.
Cada muestra es ltrada y de ellas se toman alícuotas
de 1 ml, se colocan en matraces de 50 ml y se aforan
con el medio de disolución correspondiente. La
cantidad disuelta de diltiazem a cada tiempo se
determinó en un espectrofotómetro UV/VIS (marca
Shimadzu modelo UV 1700) a 237 nm con referencia
a una curva de calibración de diltiazem estándar
preparada el mismo día del análisis.
Utilizando el modelo independiente de este
estudio y las recomendaciones de la FDA y OMS, se
comparan los perles de disolución por medio de
los factores f1 y f2; donde f1 está entre 0 y 15 y los
valores de f2 están entre 50 y 100 (WHO, 2005)
Análisis estadístico
Los resultados de los parámetros de calidad,
así como los de la validación, fueron procesados
estadísticamente, se calcularon la media, desviación
estándar y el coeciente de variación y las medias
se compararon por un análisis de varianza de una
sola vía. Valores de P<0,05 fueron considerados
signicativos.
La comparación de los perles se realizó con
el empleo del método independiente que utiliza el
factor de similitud para comparar el comportamiento
entre los lotes del producto de referencia con los
lotes de los productos prueba, tomando los valores
de porcentaje disuelto acumulado (PDA promedio);
de los perles de disolución de las tabletas de cada
lote, en cada intervalo de tiempo y calculando el
factor f1 de diferencia y el factor f2 de similitud con
las ecuaciones siguientes (FDA, 2019).
38
Volumen 13, Número 34, Septiembre-Diciembre 2020, pp. 34 - 46
III. RESULTADOS
Determinación de los parámetros de
control de la calidad.
En la tabla 1 se exponen los resultados obtenidos
para los diferentes parámetros evaluados del control
de calidad de las tabletas de diltizem genéricas y el
producto innovador.
Tabla 1. Parámetros fisicoquímicos de los lotes de Diltiazem 60 mg y del producto innovador Incoril.
Leyenda: Letras iguales para un mismo parámetro indican que no hay diferencias significativas para p<0,05; X +SD
= valor medio ± desviación estándar
Parámetros
Lotes (X +SD)
A B C D
Peso mg 239,67 ± 2,13 a 239,09 ±1,14 a
239,07 ±
2,40 a
238,99 ± 2,24 a
Diámetro en mm 8,14 ± 0,01 b 8,14 ± 0,01 b 8,14 ± 0,01 b 8,14 ± 0,01 b
Espesor en mm 3,75 ± 0,01c 3,75 ± 0,01c 3,75 ± 0,00 c 3,75 ± 0,00 c
Dureza Kg F 11,25 ± 0,38 a 10,93 ± 055 a 11,0 ± 0,53 a 11,1 ± 0,45 a
Friabilidad (%) 0,23 ± 0,00 b 0,29 ± 0,00 b 0,17 ± 0,00 b 0,22 ± 0,00 b
Tiempo de desintegración (min). 3,83 ± 0,75 c 4,66 ± 0,51 c 3,66 ± 0,51 c 4,00 ± 0,52 c
Uniformidad de contenido (%) 99,88 ± 0,66 d 100,23 ± 0,59 d 100,00± 0,41d 100,22 ± 0,60d
Perl de disolución (%) 100,24 ± 0,28 e 100,28 ± 0,37 e 100,18 ± 0,34e 100,23 ± 0,63e
Validación del método de análisis
La recta de mejor ajuste, con la ecuación y=
42,533x + 0,0195, coeciente de correlación
R=0,9999, por encima del rango de especicación,
que es mayor a 0,980; se obtuvo en el análisis
de linealidad. La gura 1, expone el gráco de
absorbancia & concentración para denir la
linealidad del método
Figura 1. Gráfica de linealidad de las tabletas de Diltiazen 60 mg
39
Soledispa et al. Validación del método de análisis de Diltiazem tabletas 60 mg
Tabla 2. Datos de Precisión intermedia (n=5)
Días
Porcentaje de concentración
Analistas
Parámetros estadísticos
1 2 3 X±SD CV (%)
1 99,477 99,533 99,548 99,519±0,037 0,038
2 99,340 99,476 99,589 99,468±0,124 0,127
3 99,557 99,766 100,032 99,785±0,238 0,238
X±SD 99,457±0,110 99,592±0,126 99,724±0,220
X
total
=99,590±0,024
CV
total
=0,143
CV 0,110 0,126 0,220
En las guras 2 A, B y C se exponen los resultados
obtenidos para la evaluación de la linealidad en tres
Precisión intermedia
Los resultados para la determinación de la
Repetibilidad entre concentraciones
Los coecientes de variación para la
Figura 2. Curvas de calibración de la linealidad del método analítico por espectrofotometría UV. (A), (B), (C)
días consecutivos para la curva de calibración.
precisión intermedia se presentan en la tabla 2
determinación de la repetibilidad entre
concentraciones se presentan en la tabla 3.
40
Volumen 13, Número 34, Septiembre-Diciembre 2020, pp. 34 - 46
Tabla 3. Repetibilidad entre concentraciones
Tabla 4. Especificidad para el método
Tabla 5. Parámetros de validación para Diltiazem.
Nivel de concentración (%) X % S
2
SD CV
90 90,1973 0,09174 0,3029 3,4E-05
100 99,388 0,04168 0,2042 2,1E-05
110 110,687 0,79609 0,8922 8,1E-05
Réplicas
Resultados de la absorbancia a 237 nm
Blanco Placebo SR
Placebo + 100%
principio activo
1 0,000 0,002 0,850 0,860
2 0,000 0,003 0,855 0,859
3 0,000 0,002 0,856 0,858
Media 0,000 0,002 0,854 0,859
Parámetros Diltiazen 60 mg tabletas
% CV Repetibilidad 0,073771082
% CV Reproducibilidad 0,080242205
Exactitud % 1,8
Incertidumbre 0,00531
Linealidad 0,990
En la especicidad se obtuvieron resultados
similares para blancos y placebos (Tabla 4), lo
cual demostró que no existían interferencias
en la respuesta analítica debido a la presencia
Resumen de los parámetros de validación
determinados
En la tabla 5, se resumen los parámetros de
Perfiles de disolución
Los perles de disolución de los tres lotes
de los excipientes empleados en la formulación
de las tabletas. Estos resultados demuestran la
especicidad del método frente a los restantes
componentes de la formulación.
validación establecidos para la técnica analítica
por espectrofotometría UV para las tabletas del
Diltiazem 60 mg.
ensayados y del medicamento innovador Incoril a
los diferentes pH y tiempos, se exponen en la gura
3.