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Hidrólisis enzimática de polvillo de arroz para la
producción de etanol de segunda generación
Rice powder waste enzymatic hydrolysis for
production of second generation ethanol
Resumen
El objetivo de la presente investigación fue hidrolizar el polvillo de arroz a azucares reductores y mediante fermentación alcohólica
obtener bioetanol. Se prepararon nueve soluciones de polvillo de arroz molido (8%, 13 % y 18%) y agua puricada e inoculados
con conidios de Trichoderma spp en concentraciones (0,2 g/L, 0,4 g/L y 0,6 g/L), los cuales se incubaron a 30°C por 144 horas.
Mediante el método DNS (3, 5 ácido di nitrosalisilico), se cuanticó los azúcares reductores: tratamiento A: 4,32 ± 0,08%, B: 5,27 ±
0,07%, C: 5,10 ± 0,01%, D: 5,53 ± 0,12%, E: 8,24 ± 0,06%, F: 6,37 ± 0,07%, G: 5,13 ± 0,02%, H: 7,19 ± 0,26%, I: 9,69 ± 0,18% y el
etanol mediante cromatografía de gases. El tratamiento que presentó mayor porcentaje de bioconversión fue el tratamiento I (18%
y 0,6 g/L de inóculo), donde la concentración de glucosa, fue 9,88%, y el rendimiento de etanol fue de 5° GL. En conclusión, es po-
sible hidrolizar los carbohidratos totales presente en el polvillo de arroz en azucares reductores y posterior fermentación alcohólica.
Palabras clave: Azucares reductores, Bioconversión, Celulasas, Cromatografía de Gases, Saccharomyces cerevisiae, etanol.
Abstract
The objective of the present investigation was to hydrolyze the rice powder to reducing sugars and, through alcoholic fermentation,
obtain bioethanol. Nine solutions of ground rice powder (8%, 13% and 18%) and puried water were prepared and inoculated with
conidia of Trichoderma spp in concentrations (0.2 g / L, 0.4 g / L and 0.6 g). / L), which were incubated at 30 ° C for 144 hours. Using
the DNA method (3, 5 di nitrosalisilic acid), the reducing sugars were quantied: treatment A: 4.32 ± 0.08%, B: 5.27 ± 0.07%, C: 5.10
± 0, 01%, D: 5.53 ± 0.12%, E: 8.24 ± 0.06%, F: 6.37 ± 0.07%, G: 5.13 ± 0.02%, H: 7, 19 ± 0.26%, I: 9.69 ± 0.18% and ethanol by gas
chromatography. The treatment with the highest percentage of bioconversion was treatment I (18% and 0.6 g / L inoculum), where
the glucose concentration was 9.88%, and the ethanol yield was 5 ° GL. In conclusion it is possible to hydrolyze the total carbohydrates
present in the rice powder bz reducing sugars and the subsequent alcoholic fermentation.
Keywords: Reducing Sugars, Bioconversion, Cellulases, Gas Chromatography, Saccharomyces cerevisiae, Ethanol.
Recibido: 16 de julio de 2019
Aceptado: 27 de noviembre de 2019
José, Ayala-Armijos
1
*; Geanina, Machuca-Loja
2
; Paola, Benítez-Castrillón
3
;
Jessica, Alvarado-Cáceres
4
1
1Magister en Procesamiento de Alimentos; Docente Titular agregado 3 de la Universidad Técnica de Machala-Ecuador; jayala@
utmachala.edu.ec; https://orcid.org/0000-0003-0148-4433
2
2Bioquímica Farmacéutica; Técnico de Laboratorio; Universidad Técnica de Machala-Ecuador; gmachuca_est@utmachala.edu.ec;
https://orcid.org/0000-0002-6798-9074
3
Química y Farmacéutica; Universidad de Guayaquil; Guayaquil-Ecuador; mayra.villavicenciov@
ug.edu.ec
3
Magister en Gerencia y Salud para el Desarrollo Local; Profesor ocasional 1de la Universidad Técnica de Machala-Ecuador; pbenitez@
utmachala.edu.ec; https://orcid.org/0000-0001-9157-8825
4
Magister en Medicina Forense; Profesor Ocasional 1 de la Universidad Técnica de Machala-Ecuador; jvalvarado@utmachala.edu.ec;
https://orcid.org/0000-0002-6976-8726
* Autor para correspondencia: tatiana.zamoraz@ug.edu.ec
Revista Ciencia UNEMI
Vol. 13, Nº 32, Enero-Abril 2020, pp. 41 - 50
ISSN 1390-4272 Impreso
ISSN 2528-7737 Electrónico
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Volumen 13, Número 32, Enero-Abril 2020, pp. 41 - 50
I. INTRODUCCIÓN
En la naturaleza existen diversas fuentes de
residuos y subproductos lignocelulósicos disponibles
en abundancia, renovables y de bajo costo (Salanti,
Zoia, Tolppa, & Orlandi, 2012). Los materiales
lignocelulósicos se componen de polímeros de
hidratos de carbón (almidones, celulosa, lignina
y hemicelulosa) que contienen aproximadamente
68,4% de polisacáridos principalmente de pentosa
y hexosa, las cuales se forman de cadenas lineales
de β (1-4) de la D–glucopiranosa (Sofía & Paz, s.
f.). Las diferentes propiedades físicas y químicas
de la lignina pueden tener varios efectos sobre la
hidrólisis enzimática de sustratos lignocelulósicos
(Hongdan Zhang, Wu, & Xie, 2017). Los almidones,
la celulosa y hemicelulosa están formada por
monómeros de D-glucosa unidos por enlaces β-1,4,
difíciles de hidrolizar a sus monómeros, debido a la
presencia de la lignina y la cristalinidad altamente
organizada de la celulosa(Salanti et al., 2012). La
hemicelulosa es un heteropolímero de hidratos de
carbono compuesto de varios azúcares diferentes,
incluyendo azúcares de cinco y seis carbonos, y puede
ser fácilmente descompuesta a sus monómeros. La
estabilidad hidrolítica y la solidez estructural de la
celulosa y hemicelulosa presentes en las plantas ha
evolucionado para resistir a la degradación, esta
robustez o dureza es atribuible a la reticulación
entre los polímeros de hidratos de carbono y el
polímero aromático (lignina) a través de los enlaces
éster y éter. Estos enlaces éster y éter entre los
azúcares oxidados, los ácidos urónicos, fenoles y
fenilpropanoles, surgen como parte funcional de la
lignina. El residuo digerido en el rumen de la paja
de arroz contiene carbohidratos residuales altos, que
lo convierte en una posible materia prima de etanol
(Haibo Zhang et al., 2018). Una fuente renovable
de biomasa es el polvillo de arroz, subproducto del
pelado y pulido del grano de esta gramínea, el cual
posee una composición de 68,44% de carbohidratos
solubles y 11,51% de proteína (Salanti et al., 2012).
Para extraer los azúcares fermentables del
polvillo de arroz, se requiere reducir el tamaño de
partícula y someter a una hidrolisis enzimática para
separar la celulosa, hemicelulosa y almidones de la
lignina, porque la lignina posee un complejo sistema
de uniones químicas difíciles de romper (Ren, Zhao,
Chen, Guo, & Cao, 2015).
Los monosacáridos resultantes de la hidrolisis
enzimatica de los carbohidratos presentes en el
polvillo de arroz pueden ser fermentados a etanol,
mientras que un alto porcentaje de pentosas en la
hemicelulosa, tales como xilosa no son fáciles de
fermentar por Saccharomyces cerevisiae(Ren et al.,
2015).
Las barreras técnicas y las limitaciones
fundamentales en los procesos de la
despolimerización de azúcar han demostrado ser
complejos y difíciles de superar(Jiang et al., 2016).
La hidrólisis enzimática de celulosa , hemicelulosa y
almidones se desarrolla mediante la intervención de
múltiples enzimas celuliticas (Diego, 2015).
Las celulasas, hemicelulasas y amilasa son
capaces de degradar los carbohidratos presentes en el
polvillo de arroz en azúcares solubles que pueden ser
fermentados para producir bioetanol. Actualmente, la
sacaricación de residuos lignocelulósicos mediante
hidrólisis enzimática produce bajos rendimientos, lo
que diculta el proceso de producción de bioetanol
comercial (Greene, Himmel, Beckham, & Tan, 2015),
el bioetanol es una fuente de energía renovable que
puede reducir consumo de combustibles fósiles y
contaminación ambiental (Shokrkar, Ebrahimi, &
Zamani, 2018). Existen microorganismos como el
Trichoderma spp que es un hongo con capacidad de
producir grandes cantidades de enzimas celulíticas,
cuya acción sinérgica puede sacaricar biomasa
lignocelulósica en azucares solubles y fermentables
(Seiboth, Verena, & Seibot, 2011). Trichoderma
reesei Aq-5b y Trichoderma viride NSW-XM capaces
de excretar enzimas degradantes de lignina y celulasa
para crear un sistema de cultivo mixto para hidrolizar
el polvillo de arroz (Wu et al., 2016). Las enzimas
que produce este microorganismo se dividen en
cuatro categorías en función de la acción catalítica
de celulosa: exoglucanasas, endoglucanasas, beta-
glucosidasas, y monooxigenasas. La sacaricación
y fermentación simultáneas (SSF) es un proceso
prometedor para la conversión de lignocelulósico
materiales para biocombustibles. Sin embargo, los
productos nales de fermentación podrían inhibir la
sacaricación de los lignocelulósicos por las enzimas
que degradan la celulosa (Nan et al., 2019).
Teniendo en cuenta toda esta evidencia cientíca
y en búsqueda de una eciente bioconversión de
la biomasa lignocelulósica para la producción de
│ 43
Ayala et al. Hidrólisis enzimática de polvillo de arroz para la producción de etanol de segunda.
etanol de segunda generación, el principal objetivo
es estudiar:
La formación de sustancias inhibidoras y
determinar su reducción mediante la aplicación de
un pretratamiento ecaz; control de los parámetros
sicoquímicos del proceso de hidrólisis: temperatura,
oxigenación, pH, agitación y concentración de
nutrientes del medio de cultivo (Diego, 2015).
Los avances en biotecnología en las últimas
décadas nos brindan herramientas necesarias
para producir etanol a partir (Raele, Boaventura,
Fischmann, & Sarturi, 2014) de la bioconversión de
carbohidratos complejos a glucosa, fructosa, xilosa
a partir de residuos agroindustriales mediante un
proceso de hidrólisis enzimática. Este nuevo método
de producción se lo denomina etanol de segunda
generación(Raele et al., 2014). En las peladoras
de arroz existentes en la provincia de El Oro, el
polvillo de arroz no es utilizado adecuadamente con
nes económicos, existiendo grandes volúmenes
procedentes del proceso de pilado, lo que constituye
una pérdida, ya que puede ser utilizado en: obtención
de jarabes glucosados, preparación de medios de
cultivos agrícolas, obtención de etanol, etc. Por lo tal
el salvado de arroz es una materia prima prometedora
para la producción de etanol, el arroz es un cultivo
importante en países como China, India, Indonesia
y Bangladesh; la producción de arroz en todo el
mundo fue alrededor de 750 millones de toneladas
en 2014 (Santos Michel et al., 2016).
La biomasa lignocelulósica es una materia
prima abundante y una alternativa para
portadores de energía a base de fósiles y productos
químicos, prometedora para la producción de
biocombustibles(Li et al., 2018). La lignocelulosa
se compone de tres principales polímeros, a saber,
celulosa, hemicelulosas y lignina, así como pequeñas
cantidades de pectinas, extractos y proteínas(Kellock
et al., 2019). La bioconversión de biomasa
lignocelulósica en biocombustibles y productos
bioquímicos que se reere al pretratamiento, la
hidrólisis enzimática y la fermentación ha ganado más
y más atención debido a su reciclaje efectivamente
sostenible de desechos lignocelulósicos, la reducción
de emisión de CO2, bajo aporte de energía, impacto
ambiental débilmente adverso, y producción de
productos de alto valor agregado(Limayem & Ricke,
2012).
Al realizar un diseño de experimentos factorial,
se desarrollaron 9 experimentos, a los cuales se
les monitoreo las condiciones del proceso como
temperatura, pH y agitación del medio de cultivo.
Se utilizó conidios del hongo Trichoderma spp
liolizado de la marca comercial Trichoeb® 5 WP,
producido por Ecuabiologica. La adaptación se
realizó en un Erlenmeyer de 500 mL que contenía
200 mL de sustrato (polvillo de arroz y agua
destilada). Una vez homogénea la mezcla, se inoculó
II. METODOLOGÍA
Población y muestra
La muestra objeto de estudio fue el polvillo de
arroz clasicado mediante tamaño de partícula
(315, 400 y 500 µm) de la variedad INIAP-14,
semillas mejoradas por el Instituto Nacional
de Investigaciones Agropecuarias de Ecuador.
Las muestras fueron recogidas en el sector
arrocero denominado “La Cuca”, perteneciente
al cantón Arenillas, provincia de El Oro-Ecuador.
Coordenadas: 3°33´ S 80°04”0; 3°33´ S 80°04” O.
Diseño del experimento
El proceso de hidrólisis enzimática del polvillo
de arroz se lo realizó mediante la utilización de las
enzimas producidas por Trichoderma spp (Rana,
Eckard, Teller, & Ahring, 2014), la cual se realizó
a temperatura constante de 30°C y oxigenación el
medio de cultivo (aireación mecánica). Se estudió
el efecto de la concentración de sustrato y la
concentración inóculo sobre la concentración de
azucares reductores obtenidos. Se desarrolló un
experimento factorial:
El factor A: Efecto de la concentración de
sustrato, tuvo tres concentraciones: 8, 13 y 18%.
Factor B: Efecto de la concentración de inóculo,
a tres concentraciones: 0,2, 0,4 y 0,6 g/L. A
continuación, se detalla la combinación factorial del
experimento.
Tabla 1. Combinación factorial del experimento
Factor A: %
sustrato
Factor B: [ g/L ] inóculo
I
1
I
2
I
3
S
1
S
1
I
1
S
1
I
2
S
1
I
3
S
2
S
2
I
1
S
2
I
2
S
2
I
3
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S
3
I
1
S
3
I
2
S
3
I
3
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0,2, 0,4 y 0,6 g/L de conidios del hongo crecidas en
una solución de CMC al 4 %.
A partir de los datos obtenidos se realizó un
análisis de varianza de los datos utilizando el
sofware Statgraphics Plus 5. Posteriormente se hizo
la representación gráca mediante el sofware Origin.
50.
Preparación del material lignocelulosico
Los residuos lignocelulósicos, después de ser
recolectados y seleccionados son molidos mediante
la utilización del Molino Fritsch-pulverisette 19,
y luego clasicados por tamaño de partícula. Este
proceso es fundamental para aumenta el área de
ataque por el hongo y mejora la eciencia de la
hidrólisis(Sánchez Riaño, Gutiérrez Morales, Muñoz
Hernández, & Rivera Barrero, 2010).
Esterilización del hidrolizado
El polvillo de arroz, mezclado con agua puricada
en porcentaje de 8, 13 y 18% m/v fue sometida a
esterilización industrial (121°C * 15 min), con la
nalidad hidrolizar parcialmente los almidones,
celulosa, hemicelulosa y eliminar microorganismos
que puedan interferir en el proceso.
Hidrólisis enzimática (Carbohidratos -
azucares fermentables).
Al medio de cultivo se le inoculo 0,2, 0,4 y 0,6 g/L,
conidios del hongo Trichoderma spp de acuerdo al
experimento que correspondía. La hidrólisis del
polvillo de arroz se llevó a cabo en 144 horas, lo cual
dependió de la concentración de inóculo adicionado
al medio (Dwivedi, Alavalapati, & Lal, 2009).
Filtración y pasteurización del hidrolizado
enzimático
Culminado el proceso de hidrolisis enzimática, al
cabo de 144 horas, se ltró el hidrolizado para retirar
los carbohidratos no hidrolizados y se detoxicó
añadiendo 0,1 g/L de cloruro de calcio di hidratado
(CaCl
2
*2H
2
O) y se procedió a pasteurizar (75°C * 15
min) el medio para eliminar la presencia del hongo
y sus clasmidospora (Bonilla, Armijos, & Calderón,
2015).
Fermentación alcohólica.
Al hidrolizado pasteurizado se le inoculó 4 g/L
de levadura Saccharomyces cerevisiae Hansen
1883 (NCYC 366), se obtuvo de la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT) de la Universidad
de Valencia y se dejó fermentar por 72 horas,
tiempo necesario para la fermentación alcohólica
de los azucares fermentables, presentes en el
hidrolizado(Philippidis, Smith, & Wyman, 1993).
Control del proceso de hidrólisis enzimatica
Determinación de Azucares Reductores.
Mediante la utilización del método de ácido
3,5-dinitrosalicilico por espectrofotometría UV-
Visible, se cuantico los azucares reductores
totales, utilizando como estándar glucosa anhidra
(Vásquez, 2010) el cual se basa en la reducción
del ácido 3-5 dinitrosalicilico a 2 amino 5 nitro
salicílico por la acción de azucares reductores (ácido
galacturonico), el cual forma un color naranja de
intensidad proporcional a los grupos reductores que
reacciona y que presenta una máxima absorción a
una longitud de onda de 540 nm (Detns et al., s. f.).
Para la calibración del espectrofotómetro se realizó
una curva de calibración con soluciones de glucosa a
cinco concentraciones diferentes (2, 4, 6, 8 y 10 g/L),
calculándose la recta de mejor ajuste por el método
de los cuadrados cuya ecuación es y = 0,1928 X –
0,020459, y el coeciente de correlación de R
2
=
0,9918.
│ 45
Ayala et al. Hidrólisis enzimática de polvillo de arroz para la producción de etanol de segunda.
Determinación de Etanol en el hidrolizado
Las concentraciones de etanol en el fermentado
del hidrolizado se analizaron utilizando el
Cromatógrafo de gases FULI 9790 II, con tiempo de
retención de 1,300 min, respectivamente, utilizando
una columna FULI Carbohydrates Ca, con agua
como eluyente, a una temperatura de 90ºC, sobre
un volumen de muestra de 10 μL, ujo de 0,5 mL/
min, presión en la columna de 1,070 ± 0,10 (utilizar
Figura 1. Curva de calibración para azucares reductores.
Figura 2. Composición polvillo de arroz.
sistema internacional de medida kN, kPas, u otro)
y sistema de detección de índice de refracción (De
Queiroz et al., 2016).
III. RESULTADOS
Caracterización Química
Los resultados obtenidos en la caracterización
química del polvillo de arroz utilizado como sustrato
para la hidrólisis enzimática presento la siguiente
composición:
46 │
Volumen 13, Número 32, Enero-Abril 2020, pp. 41 - 50
El análisis del polvillo de arroz indica que
existe un 70% de carbohidratos totales, los cuales
están disponibles para bioconvertirse en azucares
La gura 3 muestra el descenso del pH durante
el tiempo de hidrólisis del polvillo de arroz, el cual
disminuye signicativamente en los 9 tratamientos,
en el mayor de los casos desde 6,32 –3,8 en el
tratamiento D, estabilizándose después de 144 horas
de hidrólisis en todos los tratamientos lo cual indica
que el bioincremento micelial del hongo tiende a
disminuir el pH del hidrolizado el cual se reeja en
fermentables y posterior fermentación a etanol de
segunda generación.
Determinación del pH de los experimentos,
durante el tiempo de hidrólisis
Figura 3. Determinación del pH de los 9 experimentos estudiados
una desdoblación de azucares complejos en azucares
simples como es la glucosa (Nitta et al., 2012).
Cuanticación de Glucosa en el Hidrolizado
En la hidrólisis enzimática se demuestra que
la interacción entre la concentración de inóculo y
concentración de sustrato tiene efecto signicativo
(p<0,05) en la producción de glucosa tal como
indica la tabla 2.
Tabla 2. Determinación de glucosa en el hidrolizado
Tratamientos Media Varianza C. V. N
A=15% sustrato, 0,2 g/L Inóculo
4,32 0,08 1,85 3
B=15% sustrato, 0,4 g/L Inóculo
5,27 0,07 1,32 3
C=15% sustrato, 0,6 g/L Inóculo
5,10 0,01 0,19 3
D=20% sustrato, 0,2 g/L Inóculo
5,53 0,12 2,16 3
E=20% sustrato, 0,4 g/L Inóculo
8,24 0,06 0,72 3
F=20% sustrato, 0,6 g/L Inóculo
6,37 0,07 1,09 3
G=25% sustrato, 0,2 g/L Inóculo
5,13 0,02 0,38 3
H=25% sustrato, 0,4 g/L Inóculo
7,19 0,26 3,61 3
I=25% sustrato, 0,6 g/L Inóculo
9,69 0,18 1,85 3
F = 91,08239
p = 5,66547E-13
│ 47
Ayala et al. Hidrólisis enzimática de polvillo de arroz para la producción de etanol de segunda.
Figura 4. Incremento de la produción de azucares reductores en los 9 tratamientos
De acuerdo al análisis de varianza podemos ver
que si existe diferencia estadísticamente signicativa
(p<0,05) entre los 9 tratamientos estudiados, el
tratamiento que produjo mayor concentración
de azucares reductores fue el tratamiento I con
La Figura 4, muestra que existe interacción
entre la concentración de sustrato e inóculo en
la conversión de carbohidratos totales a azucares
reductores, mayor cantidad de sustrato e inóculo
mayor concentración de azucares, alcanzándose en
el tratamiento I (18% sustrato, 0,6 g/L Inóculo) el
9,88% de AR. En la hidrólisis enzimática del polvillo
de arroz utilizando el hongo Trichoderma spp, se
obtuvo una concentración del 9,88% de AR, valores
similares reportaron Saha et al. (2011), quienes
consiguieron un contenido de glucosa del 9, 2% al
hidrolizar paja de trigo(Chakraborty, Chowdhury, &
Das Saha, 2011).
9,69%, cuya composición fue de 18% de polvillo de
arroz y 0,6 g/l de inóculo. Este hecho también se
puede observar en la Figura 4, donde al aumentar
la concentración de sustrato e inóculo se produce
un incremento en la concentración de azucares
reductores.
Determinación de etanol en las
fermentaciones de los hidrolizados
La fermentación de los azúcares presentes en los
hidrolizados de polvillo de arroz, es cercana al 100%
en los 9 tratamientos estudiados, lo cual indica que el
proceso de fermentación se desarrolló con eciencia
cercana al 100%.
La Figura 5 nos indica las concentraciones
de etanol presentes en la fermentación de los
hidrolizados de los 9 tratamientos (A, B, C, D, E, F,
G, H e I).
48 │
Volumen 13, Número 32, Enero-Abril 2020, pp. 41 - 50
Figura 5. Concentración de azucares reductores VS concentración de etanol
La reducción de la concentración de azucares
reductores en el proceso de fermentación es completa
llegando a concentraciones residuales menores al
0,1%, lo cual indica la conversión de los azucares
reductores en etanol, alcanzándose concentraciones
del 5 ,09% en el tratamiento I (18% de sustrato y 0,6
g/L de inóculo).
IV. CONCLUSIONES
La molienda aplicada al polvillo de arroz, redujo
el tamaño de partícula (≤ 250 µm), aumento su
densidad aparente, mejoro la solubilidad y aumento
el área de ataque para el hongo, estudios similares
en los que se realizaron pretratamientos como la
molienda, se produjo una mejor solubilidad del
polvillo con tamaño de partícula menor a 300 µm
(Jamshidian, Golparvar, Naderi, & Darkhal, 2013).
El decrecimiento del pH en el medio de cultivo,
brindó las condiciones óptimas de hidrólisis, ya
que al aumentar el biocrecimiento miselar del
hongo existió mayor actividad enzimática dando
como resultado mayor concentración de azucares
reductores (Singhania, 2011), el análisis de varianza
aplicado al experimento indica que existe inuencia
directa en la concentración de inóculo y sustrato,
a mayor concentración de sustrato e inóculo, se
obtendrá mayor % de azucares reductores-etanol. La
levadura (Saccharomyces cerevisiae) termoestable
fue capaz de fermentar de manera eciente todos
los azucares reductores presentes en el hidrolizado
a etanol, al inmovilizar la levadura que se produjo
en el proceso de fermentación puede ser reutilizada
con eciencia cercana al 100%, reduciendo de esta
manera los costos del proceso, reutilización similar
proponen algunos investigadores (Cunha, Aguiar,
Romaní, Oliveira, & Domingues, 2015).
V. REFERENCIAS
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