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Evaluación del extracto de Semillas Citrus paradisi
para inhibición de Vibrio parahaemolyticus en
Litopenaeus vannamei.
Evaluation of the of the extract of seeds Citrus
paradisi for inhibition of Vibrio parahaemolyticus in
Litopenaeus vannamei.
Resumen
Los cultivos larvales de Litopenaeus vannamei presentan altas mortalidades por la presencia del patógeno Vibrio parahaemolyticus,
siendo combatido con antibióticos, lo que genera presión de selección y resistencia bacteriana. Por lo que se evaluó el extracto en
testas de Citrus paradisi para inhibir la proliferación de V. parahaemolyticus y mejorar la supervivencia de L. vannamei, realizado
en la Ponticia Universidad Católica del Ecuador Sede Manabí, durante octubre y diciembre 2019. Por ello, se realizaron ensayos de
concentración mínima inhibitoria CMI, movilidad, crecimiento, biopelícula y toxicidad realizadas con postlarvas de L. vannamei.
Los resultados demuestran inhibición del crecimiento bacteriano a diferentes concentraciones; la actividad en CMI se observó a 43
mg/ ml de extracto; para el ensayo de movilidad, biopelícula y crecimiento bacteriano la inhibición resulta a 5,3 mg/ml. El ensayo
de toxicidad determina que sometidas a concentraciones de 0,08-0,325 mg/ml mantienen una supervivencia del 60%, pero en
concentraciones de 0,650 mg/ml la supervivencia disminuye a 33%, comprobándose que concentraciones altas son más tóxicas
para las postlarvas. Se concluye que, en concentraciones elevadas, el extracto de C. paradisi inhibe la proliferación bacteriana del
patógeno V. parahaemolyticus, siendo recomendable su uso como desinfectante en instalaciones para el cultivo larvario de L.
vannamei.
Key words: Citrus paradisi, cultivo, Litopenaeus vannamei, potencial inhibitorio
Abstract
This quantitative research study assessed the potential of Citrus paradisi seed extract to inhibit the proliferation of Vibrio para-
haemolyticus and improve the survival of Litopenaeus vannamei in vitro. Farming of white shrimp L. vannamei has high mortality
rates because of the presence of the pathogenic V. parahaemolyticus, which is treated with antibiotics, and this produces selection
pressure and antibiotic resistance. Accordingly, this research was carried out in the microbiology laboratory at Ponticia Uni-
versidad Católica del Ecuador, Manabí from October through December 2019. There were conducted some assays of minimum
inhibitory concentration –MIC– Test, motility, growth, biolm, and toxicity with L. vannamei postlarvae. The ndings reveal that
there is inhibition of bacterial growth in the assays at different concentrations; the activity in MIC is seen in 43 mg/ml of extract,
and in the motility assay the inhibition corresponds to 2,6 mg/ml. In bacterial growth assays, concentrations of 5,3 mg/ml cause
inhibition, whereas in biolms inhibition occurs at 2,6 mg/ml. By working to improve survival of larvae, toxicity testing show that
when they are subjected to concentrations ranging from 0,08 to 0,325 mg/ml, they have larval survival up to 60%, but with concen-
trations of 0,650 mg/ml, larval survival decreases by 33%; this determines that higher concentrations are more toxic for postlarvae.
It is concluded that high concentrations of C. paradisi seed extract do inhibit bacterial proliferation of V. parahaemolyticus, and it
is recommended as a disinfectant in facilities of L. vannamei larval farming.
Palabras clave: Citrus paradisi, culture, Litopenaeus vannamei, inhibition potential
Recibido: 29 de julio de 2020
Aceptado: 15 de octubre 2020
Stephanie, Añazco-Sánchez
1
; Francisco, Pozo-Miranda
2*
1
Bióloga marina; NLProinsu, Ecuador; sanazco@nlproinsu.com
2
Biólogo Marino, Ph. D (c); Docente investigador; Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Manabí, Ecuador; fpozo@pucesm.edu.
ec; https://orcid.org/0000-0003-4294-3130
*
Autor para correspondencia: fpozo@pucesm.edu.ec
Revista Ciencia UNEMI
Vol. 14, N° 35, Enero-Abril 2021, pp. 01 - 09
ISSN 1390-4272 Impreso
ISSN 2528-7737 Electrónico
2 │
Volumen 14, Número 35, Enero-Abril 2021, pp. 1 - 09
I. INTRODUCCIÓN
En Ecuador, la economía es influenciada por el
sector acuícola (Ochoa, Campoverde, & Santacruz-
Reyes, 2017) debido a los ingresos de divisas
por exportación, generando 506000 toneladas
métricas de camarón representando 3234 millones
de dólares al mercado internacional (CNA, 2019)
siendo Litopenaeus vannamei una de las especies
más producidas en el Ecuador (FAO, 2020),
aportando además con alimentos proteicos y
fuentes de trabajo para el país (Carchipulla, 2018).
Actualmente la producción de camarón está
siendo afectada por la incidencia de bacterias
patógenas principalmente del género Vibrio, que
afecta la salud de larvas y juveniles, siendo un
factor limitante en el desarrollo del cultivo (Ochoa
et al., 2017). Esta bacteria halofílica Gram-negativa
pertenece a la familia Vibrionacea (Freitas, Glatter,
& Ringgaard, 2019). Causante de grandes pérdidas
de producción de camarón en China en el año 2009,
propagándose a Vietnam (2010), Malasia (2011),
Tailandia y Filipinas (2012) (Saavedra-Olivos et al.,
2018), detectándose en el 2013 en Centroamérica y
Suramérica (Mejías, 2018), asociada al síndrome
de mortalidad temprana (EMS, por sus siglas en
inglés), debido a la presencia de un plásmido que
posee los genes PirA y PirB, que producen toxinas
que causan la necrosis aguda en el hepatopáncreas
(Restrepo et al., 2018), y consecuentemente la
mortalidad del 100% del cultivo larval (Redrován,
2017).
Para controlar esta enfermedad caracterizada
por la necrosis aguda del hepatopáncreas
(AHPND, por sus siglas en inglés) en cultivos
larvales, los acuicultores utilizan antibióticos
como: oxitetraciclina, enrofloxacina y florfenicol,
manipulados sin criterio técnico ocasionan un
impacto ambiental negativo, ya que sus residuos se
acumulan en el fondo de los estanques. Expulsado
por medio de la excreta de los camarones, además
de provocar resistencia bacteriana (Varela Mejías
& Alfaro Mora, 2018).
Una alternativa amigable con el ambiente
es el uso de extractos de plantas, las cuales
poseen la capacidad de disminuir la propagación
bacteriana en Vibrio sp., gracias a su composición
de flavonoides (Ochoa et al., 2017). A su vez se ha
reportado que el extracto de la semilla de toronja
Citrus paradisi, combate una alta variedad de
hongos y bacterias patógenas (Maldonado, 2017)
debido a la presencia de polifenoles y flavonoides
(Oroya, 2016). Con base en lo mencionado es
importante realizar esta investigación para dar a
conocer una alternativa amigable con el ambiente
que contrarreste la propagación bacteriana en
cultivos larvales. El presente trabajo tuvo como
finalidad evaluar las propiedades del extracto de
testas de Citrus paradisi, sobre el patógeno V.
parahaemolyticus en cultivos in vitro.
II. METODOLOGÍA
Obtención de bacterias
Se obtuvieron cinco individuos Litopenaeus
vannamei de una piscina afectada por vibriosis,
de la camaronera Dufer ubicada en San Vicente
Km 5 vía Chone sector La Polvosa, Manabí con
coordenadas 0°37’07” Lat. S, 80°23’35” Long. O.
De cada organismo se extrajo el hepatopáncreas,
y maceró por separado, diluyéndose en 1,0 ml
de agua estéril en un tubo eppendorff (1.5 ml).
Posteriormente se sembró en 100 µl en agar TCBS,
e incubó por 24 h a 29,0±1,0°C.
Obtención del extracto de la testa Citrus
paradisi
Las semillas de Citrus paradisi fueron pre
secadas al ambiente, luego se obtuvo la testa para
su secado completo en estufa a 80±1°C. Una vez
seca la testa se dejó en etanol (96%) para que
actúe como solvente de extracción durante 24
h en una plataforma de agitación (Heidolh). Se
procedió a filtrar y el sobrenadante se colocó en el
rotavapor 30±1°C a 3 rpm. Se recuperó el 4% del
volumen de trabajo. Este se colocó en un recipiente
ámbar estéril que no permitió el paso de la luz. A
continuación, se cerró herméticamente y congeló
hasta su uso.
Reactivación de la cepa bacteriana
De las cepas extraídas de V. parahaeolyticus se
tomaron las colonias por medio de un asa de vidrio
y se inoculó en medio de Peptona (Acumedia LAB)
en tubos de ensayo estériles. Se incubó hasta que el
crecimiento fue equivalente a una turbidez de 0,1
de densidad óptica (DO).
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Añazco y Pozo. Evaluación del extracto de Semillas Citrus paradisi
Concentración mínima inhibitoria CMI
Para la determinación de la CMI, en agua de
peptona (Acumedia LAB) se prepararon diluciones
del extracto de Citrus paradisi a concentraciones
de 6%=5,3 mg/ml, 12,5%= 10,7 mg/ml, 25% = 21,5
mg/ml y 50% = 43 mg/ml, y se distribuyeron en
discos de papel filtro de 6 mm de diámetro en forma
seriada en medio de cultivo LB en cajas Petri. Como
control se utilizaron discos de 6 mm de diámetro
de oxitetraciclina. Con un hisopo se inoculó por
barrido, una suspensión bacteriana de 0,1% de
densidad óptica medida en el espectrofotómetro
(Spectroquant ® NOVA60) a 600 nm de longitud
de onda (DO
600
= 0,1) y se incubó por 24 h a
29±1°C. Los análisis se realizaron con 5 réplicas
por concentración de acuerdo a Pardo., Monsalve.,
Erira., Espinosa., & Jaramillo., (2017). Para
establecer las concentraciones efectivas para
disminuir el crecimiento bacteriano se determinó
la CMI, acorde a las categorías resistente (R < 14,0
mm), intermedio (I de 15,0 a 18,0 mm) y sensible
(S > 19,0 mm).
Ensayos de motilidad
Se prepararon las diferentes soluciones del
extracto de C. paradisi para obtener en cajas de Petri
con agar LB al 0,5% y NaCl al 2%. Se distribuyeron
alícuotas de 5 μl de cultivo bacteriano de DO
600
=
1,0 en placas de agar LB. Se incubó durante 24 h
a 30±1°C y se midió el halo de movilidad (Yang et
al., 2017).
Cada tratamiento tuvo concentraciones de 10,7
mg/ml (12,5%), 5,3 mg/ml (6%) y 2,6 mg/ml (3%).
Se emplearon 5 réplicas por tratamiento.
Ensayos de crecimiento bacteriano
Para los ensayos de crecimiento bacteriano, se
cultivó V. parahaemolyticus por 24 h en medio
nutritivo Agua de Peptona (Acumedia LAB) a
una DO
600
= 0,1 con extracto y sin extracto de C.
paradisi. Las concentraciones de extractos fueron:
10,7 mg/ml (12,5%), 5,3 mg/ml (6%), 2,6 mg/ml
(3%). Los cultivos se desarrollaron en volúmenes
de 2 ml en celdas de vidrio a 29±1° C tapados
con algodón estéril durante 24 h, y la turbidez se
cuantificó cada 8 h a 600 nm por espetrofometría
(Spectroquant ® NOVA60). Se determinaron las
curvas de crecimiento de cada cultivo, empleando
5 réplicas para cada uno.
Biopelícula
Se usaron celdas de vidrio para lectura
espectrofotometría (Merck), se adicionaron medio
LB (2 ml) y los extractos de cada tratamiento:
10,7 mg/ml (12,5%), 5,3 mg/ml (6%), 2,6 mg/ml
(3%). Se distribuyó alícuotas (100 μl) de cultivos
de V. parahaemolyticus (DO
600
= 0,1) y se incubó
por 24 h a 30±1°C. Los tubos se lavaron dos veces
con tampón de fosfato salino (PBS). Se agregó
etanol (1000 μl) por 20 min, se eliminó el etanol
y se visualizó con 150 μl de cristal violeta (1,0%)
durante 15 min. Posteriormente, se eliminó el
exceso de cristal violeta mediante dos lavados
con PBS, se agregó etanol (1000 μl) y se realizó la
lectura a DO 440 nm (Lee, Cho, & Lee, 2011). Se
emplearon 5 réplicas por tratamiento.
Análisis de toxicidad del extracto sobre
postlarvas
En la evaluación de toxicidad se usaron 20
poslarvas pl8 de camarón L. vannamei por
cada recipiente plástico (150 ml), las cuales se
sometieron a 4 concentraciones de extractos que
mostraron efectividad en pruebas in vitro: 0,080
mg/ml (0,09%), 0,160 mg/ml (0,18%), 0,325 mg/
ml (0,37%) y 0,650 mg/ml (0,75%). Se usaron 3
réplicas. El análisis duró 24 h.
Análisis estadístico
Se evaluó la normalidad y homocedasticidad
de las varianzas de los datos a los análisis de
movilidad, toxicidad y sensibilidad CMI mediante
la prueba de Shapiro Wilks y Levene (α = 0,05).
Comprobada la normalidad de los datos se
evaluaron las diferencias significativas a los
tratamientos de cada prueba mediante análisis de
varianza de una vía (α =0,05) y la prueba de Tukey
(α = 0,05), para la prueba de toxicidad se evaluó
por Kruskal-Wallis y Mann-Whiney. El software
usado para el análisis estadístico fue Infostat
versión 2017.
III. RESULTADOS
Concentración Mínima Inhibitoria CMI
Se determinó que la bacteria V.
parahaemolyticus muestra efecto significativo
4 │
Volumen 14, Número 35, Enero-Abril 2021, pp. 1 - 09
(F = 8,25; Tukey p < 0,05) de sensibilidad a
concentraciones superiores a 43,0 mg/ml, siendo
esta la CMI del extracto de Citrus paradisi;
mientras que a las otras concentraciones no mostró
sensibilidad. La CMI de 43,0 mg/ml provocó un
Ensayos de motilidad
El análisis del efecto del extracto mediante la
movilidad de la cepa de Vibrios parahaemolitycus,
mostró inhibición significativa (F = 182,15; Tukey
p < 0,05) de movilidad de la colonia sobre el
medio de cultivo LB (0,5% agar) en cada una de
Ensayos de crecimiento bacteriano
El ensayo de crecimiento bacteriano se realizó
durante 24 h de cultivo y su cuantificación fue
mediante la medición de la densidad óptica por
espectrofotometría, se observó que concentraciones
evaluadas de Citrus paradisi de 10,7 y 5,3 mg/ml
fueron efectivas para controlar la proliferación
bacteriana durante de 24 h, mientras que
concentración de 2,6 mg/ml mantuvo inhibición
halo de inhibición de 33,3±2 mm de diámetro
mientras que el control con Oxitetraciclina 46,0±3
mm. Aunque los tamaños de halo del extracto y el
control difieren, son consideradas sensibles para la
inhibición del creciente bacteriano (figura 1).
las concentraciones evaluadas (10,7; 5,3 y 2,6 mg/
ml) respecto al control. En el tratamiento control si
presentó movilidad, formando un halo de 6,6±1,3
mm de diámetro (ver Imagen 1). Lo que demuestra
que el extracto fue clave, para evitar la movilidad
de la colonia en el medio de cultivo.
bacteriana hasta las 16 h de exposición al extracto,
posterior a ello (24 h) el crecimiento bacteriano
incrementó significativamente (F = 0,78; Tukey
p < 0,05) a una DO
600
. de 0,800. El control (sin
extracto) se observó un crecimiento bacteriano
normal en el trascurso del tiempo de evaluación,
observándose claramente las fases de crecimiento
latencia y exponencial como se muestra en la figura
2 (Fischer et al., 1995; Vivien et al., 2017).
Figura 1. Análisis de Concentración mínima inhibitoria CMI de extractos de Citrus
paradisi. Control Oxitetraciclina (30 µg/ml), barras verticales = desviación estándar,
letras diferentes indican diferencias significativas (p ≤ 0.05).
Imagen 1. Halos de movilidad de colonia de Vibrios parahaemolitycus, en medio de
cultivo semisólido LB suplementado con 0,5% de Agar. Línea color rojo indica tamaño
del halo de movilidad del tratamiento control negativo (sin extracto). a) control
negativo, b) tratamiento 5,3 mg/ml de extracto de Citrus paradisi.
│ 5
Añazco y Pozo. Evaluación del extracto de Semillas Citrus paradisi
Biopelícula
Se determinó la capacidad de formación y
adherencia de biopelícula bajo exposición al extracto
de Citrus paradisi durante 24 h, encontrándose
que todas las concentraciones evaluadas (10,7 y 5,3
y 2,6 mg/ml) provocaron que V. parahaemolitycus
Análisis de toxicidad y ensayo en larvas de
L. vannamei
Al evaluar la toxicidad en el organismo de
cultivo, se observó efectos tóxicos con mortalidad
del 70% de las postlarvas de L. vannamei a
concentraciones de 0,080; 0,160; 0,325 mg/ml
durante 24 h de evaluación (ver figura 4), mientras
disminuya significativamente (F = 7,26; Tukey <
0,05) la capacidad de formación de biopelícula
(DO600 promedio 0,08±0,01) respecto al control
(DO
600
= 0,16±0,09), evidenciando la efectividad
del extracto inhibir este factor de virulencia
bacteriana (ver figura 3).
que la concentración 0,650 mg/ml se muestran
altamente tóxicas, provocando la mortalidad del
60% de las larvas evaluadas. Estas presentaron
daños en las branquias y disminuyendo la
supervivencia de las postlarvas. Esto muestra alta
toxicidad del extracto en larvas durante el desafío
afectando la supervivencia de larvas de camarón,
lo cual dificulta su uso en cultivos.
Figura 2. Análisis de crecimiento bacteriano expuestos a extractos de Citrus paradisi.
Control negativo sin extracto (0 µg/ml), barras verticales = desviación estándar,
asteriscos indican diferencias significativas (p ≤ 0,05).
Figura 3. Análisis de la formación de biopelícula por V. parahaemolitycus. Control
negativo sin extracto (0 µg/ml), barras verticales = desviación estándar, asteriscos
indica diferencias significativas (p≤0,05).
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Volumen 14, Número 35, Enero-Abril 2021, pp. 1 - 09
Figura 4. Análisis de toxicidad de extractos de Citrus paradisi sobre postlarvas pl8 de
L. vannamei durante 24 h de ensayo. Valores absolutos.
IV. DISCUSIÓN
La acuacultura de camarón es una industria
de gran importancia para el Ecuador, pero una
de sus etapas críticas es la larvicultura debido
a problemas bacterianos durante el desarrollo
del cultivo. En este estudio la sensibilidad de
V. parahaemolyticus fue evaluada mediante la
CMI del extracto etanólico de C. paradisi que
presentó actividad antibacterial a 43,0 mg/
ml (50% de extracto) con un halo de inhibición
33,3±2 mm de diámetro. Resultados similares
han sido observados en otras bacterias patógenas
(Staphylococcus aureus y Streptococcus mutans),
pero a diferentes concentraciones de extractos
(25 y 50 % respectivamente) (Maldonado, 2017).
Citrus jambhir frente al patógeno Pseudomona
aeruginosa, inhibe su proliferación hasta un halo
de 9,66 mm de diámetro, mientras que, cepas
patógenas de Escherichia coli, Salmonella entérica
y Staphylococcus saprophyticu la inhibición del
crecimiento es completamente nula frente a Citrus
jambhir (Vasquez & Mendosa., 2018).
Estudios con aceites esenciales también
muestran actividad antibacteriana como es el
caso de Citrus reticulata (mandrarina), sobre
Bacillus subtilis a concentración de 9% y 19%,
Listeria monocytogenes y Staphylococcus
aureus a concentraciones de 17% y 7% (Quispe &
Zambrano, 2017). Así mismo, el aceite esencial de
Citrus sinensis (naranja dulce) presenta actividad
antibacteriana en rangos de 50% y 100% en
Staphylococcus epidermidis.
En el ensayo de movilidad se observó una
efectividad total (100%) de la inhibición a todas
las concentraciones evaluadas 10,7 mg/ml (12,5%),
5.3 mg/ml (6%) y 2,6 mg/ml (3%) durante 24
h, posiblemente la célula se vio afectada en su
fisiología y su capacidad de formación flagelar
para poder extender la colonia en presencia de
los extractos. Resultados similares se obtuvieron
en el ensayo de crecimiento celular de la bacteria,
excepto a la concentración de 5 mg/ml (6%), la
cual solo sostuvo el crecimiento hasta las 12 h, y
a partir de las 16 h presentó un incremento en la
proliferación celular. Resultados que difieren con lo
reportado para aceite esencial de C. paradisi, cuya
actividad antibacteriana es nula a concentraciones
bajas (0,25%, 0,50%, 0,75%) sobre patógenos
como: Escherichia coli, Pseudomona aeruginosas,
Salmonella typhi (Baquerizo., 2017). Esto podría
deberse a que la composición fitoquímica del género
Citrus son sustancias volátiles, que disminuyen
su concentración en el tratamiento y da como
resultado la disminución del efecto antibacteriano
(Herrera., Garcia., & Delgado., 2019), mientras que
su actividad bactericida se debería a la riqueza en
α-pineno, β-mirceno, limoneno, linalool (Alarcón,
Pájaro, & Méndez, 2017) polifenólicos incluidos
la naringina, flavanona y furanocumarinas como:
bergamotina, dihidrobergamottina (Osungunna.
& Onawunmi., 2016; (Salazar., 2019) Pardo. et al.,
2017; (Maldonado, 2017).
En biopelícula, la efectividad inhibitoria de
biopelícula durante las 24 h. Estos resultados se
muestran similares a los reportados por (Fratianni
et al., 2019), donde presenta la potencial capacidad
inhibitoria de formación de biopelicula por parte
del extracto en la testa de Citrus bergamota,
sobre las cepas: Escherichia coli, Listeria
monocytogenes, Pectobacterium carotovorum,
│ 7
Añazco y Pozo. Evaluación del extracto de Semillas Citrus paradisi
Pseudomonas aeruginosa, esto por presencia de
polifenoles en la testa.
En el ensayo de toxicidad, el extracto etanólico
de la testa de C. paradisi evaluada in vitro
presentó alta supervivencia de larvas L. vannamei
a concentraciones inferiores a 0,325 mg/ml
(0,037%), por el contrario, estudio realizado por
(Herrera. et al., 2019), observa superviviencia a
concentración de 25% de aceites esenciales en
organismos gnobióticos (nauplios de Artemia).
Esto muestra que el extracto etanólico de la testa
de C. paradisi es altamente antibacterial, pero su
toxicidad no permite su uso en cultivos acuícolas,
por lo tanto, solo sería factible como desinfectante
por un lapso corto de tiempo.
V. CONCLUSIÓN
Se establece que los extractos de testa de C.
paradisi presentan propiedades importantes en
el control de vibriosis debido a su capacidad de
inhibir el crecimiento microbiano, requiriéndose
para su aplicación una CMI de 43,0 mg/ml, siendo
alternativo al empleo de Oxitetraciclina. Además,
su efecto comprobado en este estudio sobre la
motilidad y formación de biopelícula bacteriana.
No es factible la aplicación directa de los
extractos al medio de cultivo de las postlarvas
de L. vannamei debido a la alta toxicidad sobre
éstas a concentraciones mayores de 0,325 mg/ml
(0,037 %), por lo cual su empleo estaría sugerido
como desinfectante de instalaciones y utensilios de
cultivo.
Agradecimiento
Los autores expresan su agradecimiento por el
apoyo brindado en la realización de investigación
que se desarrolló dentro del marco del proyecto
Evaluación de principios activos de plantas
superiores y algas para la inhibición de la virulencia
Vibrio parahaemolyticus con fines acuícolas.
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