22 │
Volumen. 5, Nº 9, diciembre 2021 - mayo 2022, pp. 22-28
Vargas et al. Validación de un método analíco que determina HAP’s en agua.
Validación de un método analíco que determina hidrocarburos
aromácos policíclicos en agua mediante cromatograa líquida de alto
rendimiento
Validaon of an analycal method that determines polycyclic aromac
hydrocarbons in water by high performance liquid chromatography
Resumen
La cromatograa líquida de alta resolución ene la capacidad de separar, idencar y cuancar los compuestos
que están presentes en cualquier muestra. El objevo de este estudio fue validar un método cromatográco que
permita denir si es conable y reproducible según los requerimientos establecidos en la norma ISO 17025:2017,
llegando a un nivel más bajo de acuerdo a la normava ambiental. La validación se realizó en la ciudad de Guayaquil,
Ecuador, a parr de 15 muestras en total (agua natural, potable, residual domésca e industrial), con la técnica de
extracción en fase sólida (SPE) en modalidad de cartuchos Oasis ®HLB. Para la preparación de las muestras se realizó
el acondicionamiento del cartucho OASIS agregando 5 ml de diclorometano grado HPLC, enjuage con 5 ml de me-
tanol grado HPLC y luego 5 ml de agua po I, carga de 500 ml de muestra a 15 ml/min, lavado con 5 ml agua po
I, elución con 8 ml de diclorometano (5 ml enjuagar la botella y 3 ml en el cartucho), evaporación a sequedad para
reconstuir con 2 ml de ACN, en un vial de 2 ml. La inyección del extracto se realizó en el HPLC, siendo los resultados
integrados automácamente por el soware. Los parámetros estadíscos que se generaron como resultado fueron
repebilidad, precisión intermedia, incerdumbre, veracidad, límite de detección y cuancación. Concluyendo
que el desarrollo del método analíco permite idencar 15 HAP’s con buena resolución y simetría.
Palabras Clave: agua; cromatograa; cromatograa líquida de alta resolución; hidrocarburos aromácos po-
licíclicos; HAPs; HPLC; incerdumbre; validación.
Abstract
High performance liquid chromatography has the ability to separate, idenfy and quanfy the compounds that
are present in any sample. The objecve of this study was the validaon of a chromatographic method that allows
to dene if it is reliable and reproducible according to the requirements established in ISO 17025:2017, reaching a
lower level according to environmental regulaons. The validaon was carried out in the city of Guayaquil, Ecuador,
taking 15 samples in total (natural, potable, domesc and industrial residual water), with the solid phase extracon
technique (SPE) in the form of Oasis ®HLB cartridges. For the preparaon of the samples, the OASIS cartridge was
condioned by adding 5 ml of HPLC grade dichloromethane, rinsed with 5 ml of HPLC grade methanol and then 5
ml of type I water, 500 ml of sample was charged at 15 ml / min, washed with 5 ml water type I, eluted with 8 ml
of dichloromethane (5 ml rinse the bole and 3 ml in the cartridge), evaporate to dryness to reconstute with 2 ml
of ACN, place in a 2 ml vial. The injecon of the extract was performed in the HPLC, being the results automacally
integrated by the soware. The stascal parameters that were generated as a result are repeatability, interme-
diate accuracy, uncertainty, veracity, limit of detecon and quancaon. Concluding that the development of the
analycal method allows us to idenfy 15 PAHs with good resoluon and symmetry.
Keywords: water; chromatography; high performance liquid chromatography; polycyclic aromac hydrocar-
bons; PAHs; HPLC; uncertainty; validaon.
Juliana Vargas Quezada
1
; Viviana Sánchez Vásquez
2
; Karem Veloz Pinto
3
(Recibido: mayo 18, Aceptado: octubre 29, 2021)
hps://doi.org/10.29076/issn.2602-8360vol5iss9.2021pp22-28p
1
Especialista en Gesón de Sistemas de Calidad, Analista II de Laboratorio, Grupo Químico Marcos, Guayaquil, Ecuador. Email: yulyrina@gmail.com.
ORCID: hps://orcid.org/0000-0002-1331-1559
2
Magister en Gesón de la Calidad y Producvidad, Babahoyo, Ecuador. Email: vivisv0908@gmail.com. ORCID: hps://orcid.org/0000-0001-9200-
4292
3
Química y Farmacéuca, Representante Técnica, Laboratorios Beauk, Guayaquil, Ecuador. Email: klisvp17@gmail.com. ORCID: hps://orcid.
org/0000- 0003-0695-7850
Volumen. 5, Nº 9, diciembre 2021 - mayo 2022, pp. 22-28
Vargas et al. Validación de un método analíco que determina HAP’s en agua.
│ 23
INTRODUCCIÓN
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos
(HAP’s) se originan del procesamiento o
combustión del petróleo; y son más de
100 analitos, siendo 16 los más estudiados
(Figura 1) por ser altamente cancerígenos
en concentraciones bajas (1), a pesar de
ser insolubles en el agua es necesaria su
determinación en aguas potables, naturales
y residuales (2).
Los HAP’s son compuestos orgánicos que
contienen hidrógeno y carbón, los cuales
forman anillos aromáticos, y se encuentran
comúnmente en agua, aire y suelo (3). Son
considerados contaminantes orgánicos
persistentes, hidrofóbicos, altamente
estables en el ambiente, se encuentran
presentes a bajas concentraciones (μg/L)
y su principal riesgo es su capacidad de
bioacumulación y biomagnificación. Son
peligrosos debido a su presencia, toxicidad,
destino y transporte en sistemas acuáticos
(4).
Figura 1. Fórmula Química de los 16 HAP’s
Cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC por sus siglas en inglés) es una técnica
que permite separar mezclas complejas.
La separación ocurre en una columna que
tiene un relleno poroso (fase estacionaria)
y la mezcla disuelta en un solvente (fase
móvil) pasa a través de la columna. Los
componentes (analitos) por su afinidad con
el relleno de la columna salen en diferentes
tiempos los cuales son registrados por un
detector, esta información se ve reflejada en
un Cromatograma. HPLC tiene la capacidad
de separar, identificar y cuantificar los
compuestos que están presentes en cualquier
muestra sea esta de origen farmacéutico,
alimenticio, cosmético, forense, ambiental,
es por tener estas características que se
utiliza para determinar concentraciones
bajas a nivel de trazas de compuestos como
son los HAP’s.
Uno de los principales problemas que
enfrenta la sociedad moderna es el deterioro
y creciente nivel de contaminación de los
recursos naturales; los ecosistemas se ven
alterados por una gran cantidad de sustancias
químicas tóxicas generadas por diversas
actividades industriales, de servicios,
domésticas, urbanas y agrícolas (5). El agua
es sin dudas uno de los recursos naturales
más valiosos del planeta, sin embargo, su
calidad está cada vez más deteriorada y
escasa debido al incremento de la población,
el desarrollo y la industrialización. Durante
los últimos años se ha reportado un
incremento de contaminantes orgánicos
persistentes en el agua, muchos de los cuales
son considerados potencialmente tóxicos
para el ambiente y la salud humana, como es
el caso de los HAP’s (6).
Los contaminantes orgánicos persistentes en
el agua como los hidrocarburos aromáticos
policíclicos (HAP), representan un riesgo
potencial para el ambiente y la salud (7),
de allí que su correcta identificación es
indispensable (8). El agua es un recurso natural
no renovable que debe ser preservado y para
determinar su calidad es necesario analizar
varios parámetros que están estipulados
en la ley de gestión ambiental entre ellos
los hidrocarburos aromáticos policíclicos
(9). Validar un método analítico permite
obtener valores de incertidumbre cercanos
al valor verdadero en la cuantificación de los
parámetros de estudio, pues toman en cuenta
24 │
Volumen. 5, Nº 9, diciembre 2021 - mayo 2022, pp. 22-28
Vargas et al. Validación de un método analíco que determina HAP’s en agua.
las desviaciones que pueden existir en el
momento del ensayo sean estos ocasionados
por los equipos, el personal o la aplicación
del método. (10).
La norma ISO 17025:2005 “Requisitos
generales para la competencia de los
laboratorios de calibración y ensayos” indica
que los métodos deben ser validados para
confirmar que son adecuados para el fin
previsto. Siendo este un requerimiento de
norma, nos encontramos dos investigaciones
que validan un método normalizado, pero lo
limitan a un solo tipo de agua: un método
analítico para detectar hidrocarburos
aromáticos policíclicos en agua potable EPA
550 en la ciudad de México con un equipo
HPLC acoplado a un espectrómetro de
masas (11), y la estandarización, validación
y evaluación de la concentración de
hidrocarburos aromáticos policíclicos en
aguas del rio Cuyabeno en un equipo HPLC
con detector UV-VIS y fluorescencia con el
método EPA 550.1 (9)
La validación de un método, en este caso
cromatográfico, permitirá definir si es
confiable y reproducible además según los
requerimientos establecidos en la norma
ISO 17025:2017 (12) y llegar a un nivel más
bajo de la normativa ambiental. Por lo que se
estableció como objetivo validar el método
normalizado EPA 550.1 que determina
hidrocarburos aromáticos policíclicos en
agua bajo la norma ISO 17025.
METODOLOGÍA
La extracción de los HAP’s se realizó mediante
la técnica de extracción en fase sólida (SPE
por sus siglas en inglés) en modalidad de
cartuchos Oasis ®HLB. La elución se hizo
con diclorometano y la concentración con
un rotaevaporador lo que permite llegar a
niveles más bajos de detección.
Se prepara solución stock de 16 HAP’s a partir
de estándares certificados la cual sirve para
preparar las soluciones de curva de calibración
y fortificar muestras de agua potable, natural
y residual. Se empleó un cromatógrafo de
HPLC 3000 THERMO con automuestreador,
horno de columna y detector de fluorescencia
(13). Las condiciones del equipo se presentan
en la Tabla 1.
El desarrollo de la validación se realizó en la
ciudad de Guayaquil, Ecuador, para lo cual
se tomaron 15 muestras de agua en total,
divididas en 5 por cada tipo de matriz: origen
natural del río Daule, agua potable de la
zona norte, agua residual doméstica (planta
de tratamiento) y agua residual industrial
(efluente de gasolinera), las mismas que
fueron fortificadas para su respectivo análisis.
Para la preparación de las muestras se
realizó el acondicionamiento del cartucho
Tabla 1. Condiciones de equipo HPLC
Cromatógrafo
líquido
Ulmate 3000 THERMO
Detector Fluorescencia THERMO
Tiempo
Excitación
(nm)
Emisión
(nm)
0 255 315
7 277 330
8.5 247 364
10 244 400
12 237 460
12.8 237 385
16 277 376
20 255 420
24.2 300 415
27 250 495
Columna
Hypersil Green PAH en mm 150*4.6
tamaño de parcula 5 μm
Fase móvil Agua (A) -. Acetonitrilo (B)
Tiempo Flujo % A %B
0 2 ml/min 50 50
5 2 ml/min 50 50
30 2 ml/min 1 99
31 2 ml/min 50 50
Horno de
columna
28 ºC
Duración de la
corrida
31 minutos
Volumen. 5, Nº 9, diciembre 2021 - mayo 2022, pp. 22-28
Vargas et al. Validación de un método analíco que determina HAP’s en agua.
│ 25
OASIS agregando 5 ml de diclorometano
grado HPLC, enjuage con 5 ml de metanol
grado HPLC y luego 5 ml de agua tipo I, carga
de 500 ml de muestra a 15 ml/min, lavado
con 5 ml agua tipo I, elución con 8 ml de
diclorometano (5 ml enjuague de la botella y
3 ml en el cartucho). Se evapora a sequedad
para reconstituir con 2 ml de ACN y se coloca
en un vial de 2 ml. La inyección del extracto
se realizó en el HPLC, los resultados son
integrados automáticamente por el software
Chromeleon.
La curva de calibración se estableció desde
un material de referencia certificado que
contiene los 16 HAP’s, que permite el cálculo
de los límites de detección y cuantificación
en las muestras, precisión y veracidad del
método.
Las interferencias del método pueden ser los
contaminantes en los solventes, material de
vidrio los cuales pueden elevar la línea base
en el cromatograma. Se debe demostrar que
no hay interferencias mediante la corrida de
un blanco por cada lote de muestras corridas.
La parte fundamental en la validación de
un método que determine los HAP’s es que
deben de contar con un rango de trabajo
que este dentro de los límites máximos
permisibles que la ley estipula.
Los datos obtenidos en el software
Chromeleon se evaluaron estadísticamente
mediante Análisis de Varianza (ANOVA),
una técnica estadística usada para separar
y calcular la variación debido a los errores
aleatorios de la medición de la variación
causada por cualquier otro factor que
podría introducir cambios en la medida de
la concentración de las muestras. Con los
valores obtenidos de la precisión y el error
sistemático se calculó la incertidumbre de la
medición. Se elaboró un programa en Excel
para calcular los parámetros estadísticos de
interés y la posición determinada por los
errores aleatorios.
RESULTADOS
De los 16 HAP’s en estudio quedó establecida
la validación del método para 15 HAP’s que
son los analitos que se pueden detectar y
cuantificar en el detector de fluorescencia a
excepción del Acenaftileno que solo se puede
detectar por el detector UV-Vis.
Se obtuvieron cromatogramas con la
separación de los 15 HAP’s en estudio tanto
en las matrices fortificadas de agua natural,
residual y potable como en los estándares
(ver Tabla 2). Los parámetros estadísticos
que se generaron como resultado fueron:
repetibilidad, precisión intermedia,
incertidumbre, veracidad, límite de detección
y cuantificación. No se identificaron valores
menores a 0,002 mg/l, por lo tanto, el
límite de detección (LD) es igual al límite de
cuantificación (LC) 0,002 mg/l.
Se fijaron objetivos de validación en
repetibilidad ≤ 25 % y de precisión intermedia
≤ 30% obteniéndose 5,59 % como el más alto
y de 2,80% como el más bajo. En precisión
intermedia el más alto 6,58% y de 3,96% como
el más bajo. Siendo estos datos menores
que los datos obtenidos por los referentes
empíricos. Los resultados se obtuvieron en
base al cálculo del análisis de varianza que
se realizó con las tres repeticiones durante
cinco días.
26 │
Volumen. 5, Nº 9, diciembre 2021 - mayo 2022, pp. 22-28
Vargas et al. Validación de un método analíco que determina HAP’s en agua.
El intervalo de trabajo fue de 0,002 mg/l a
0,08 mg/l, excepto para el Naftaleno que fue
de 0,008 mg/l a 0,08 mg/l. Se obtuvieron
los valores de incertidumbre para los 15
HAP’s correspondiente al 95% de confianza
presentando valores menores al 35% para
el Fluoreno 34,21%, Fenantreno 26,92%,
Fluoranteno 34,75%, Benzo (a) Antraceno
34,21%, Benzo (b) fluoranteno 32,35%,
Dibenzo (a,h) antraceno 32,05%, Benzo
(g,h,i) perileno 26,92%; y valores entre 35%-
46,01% para el Naftaleno 35,62%, Criseno,
Pireno y Benzo (a) pireno 37,73%, y para el
Acenafteno, Antraceno e Indeno (1,2,3-cd)
Pireno 46,01%.
Los valores obtenidos del porcentaje de
recuperación fueron de 98,41 para el
Fenantreno y Benzo (g,h,i) Perileno, de
101,42 - 101,95 para el Naftaleno, Pireno,
Criseno, Benzo (a) Pireno, Fluoreno y Benzo
(a) Antreceno, de 102,17 - 102,80 para
Fluoranteno, Benzo (b) fluoranteno y Dibenzo
(a,h) Antraceno, y de 104,98 para Acenafteno,
Antraceno, Benzo (k) Fluoranteno e Indeno
(1,2,3-cd) Pireno; demostrando que el
porcentaje de recuperación de cada analito
Analitos
Concentración
mg/l
Repebilidad
% CVr
Precisión
intermedia
% CVR
Incerdumbre
%U
Veracidad
% Recuperación
Naaleno 0,008 a 0,080 5,25 5,59 35,62 101,66
Acenaeno 0,002 a 0,080 5,59 6,58 46,01 104,98
Fluoreno 0,002 a 0,080 4,41 5,19 34,21 101,95
Fenantreno 0,002 a 0,080 3,04 4,08 26,92 98,41
Antraceno 0,002 a 0,080 5,59 6,58 46,01 104,98
Fluoranteno 0,002 a 0,080 2,80 3,96 34,75 102,17
Pireno 0,002 a 0,080 4,44 5,34 37,73 101,42
Benzo (a) Antreceno 0,002 a 0,080 4,41 5,19 34,21 101,95
Criseno 0,002 a 0,080 4,44 5,34 37,73 101,42
Benzo (b) Fluoranteno 0,002 a 0,080 3,61 4,81 32,35 102,80
Benzo (k) Fluoranteno 0,002 a 0,080 5,59 6,58 46,01 104,98
Benzo (a) Pireno 0,002 a 0,080 4,44 5,34 37,73 101,42
Dibenzo (a,h) Antraceno 0,002 a 0,080 5,34 6,48 32,05 102,29
Benzo (g,h,i) Perileno 0,002 a 0,080 3,04 4,08 26,92 98,41
Indeno (1,2,3-cd) Pireno 0,002 a 0,080 5,59 6,58 46,01 104,98
Tabla 2. Coeficientes de variación de Repetitividad y Precisión intermedia
cumple con el objetivo de validación
propuesto ya que todos los valores se
encuentran dentro del rango de 70 - 120%.
CONCLUSIONES
Se realizó un estudio de validación para
la determinación cuantitativa de los
hidrocarguros aromáticos policlínicos en
agua mediante cromatografía líquida de alto
rendimiento con la técnica de extracción
en fase sólida (SPE) en modalidad de
cartuchos Oasis ®HLB. Se desarrollaron
los procedimientos estadísticos de los
parámetros de validación: repetibilidad,
precisión intermedia, incertidumbre,
veracidad, límite de detección y
cuantificación; evaluando cada uno de estos
con los respectivos criterios de aceptación en
función del objetivo planteado.
El desarrollo de un método analítico
instrumental en el equipo HPLC permitió
identificar 15 HAP’s con buena resolución y
simetría. Para la determinación de la exactitud
se calculó el porcentaje de recuperación de
cada uno de los hidrocarburoa aromáticos
policíclicos, encontrando que el porcentaje
Volumen. 5, Nº 9, diciembre 2021 - mayo 2022, pp. 22-28
Vargas et al. Validación de un método analíco que determina HAP’s en agua.
│ 27
de recuperación de los 15 HAP’s está entre
98,41 y 104,98%, ninguno menor que
70% ni mayor a 120% en cada una de las
concentraciones, lo cual indica exactitud del
método. Se obtuvieron los porcentajes de los
coeficientes de variación de la repetibilidad y
de la precisión intermedia de cada uno de los
analitos para determinar si existen similitud
entre los datos en condiciones constantes o
variadas, cumpliendo los resultados con lo
estipulado.
La definición del protocolo de validación
permite tener las pautas para realizar el
número de repeticiones, las cuales generan
los datos para realizar el análisis estadístico.
La metodología es amigable con el ambiente
debido a que no emana vapores y los
residuos líquidos que genera son colectados
y eliminados a través de un gestor ambiental,
es fácil de aprender y adaptar. Después del
desarrollo de la investigación y el análisis
estadístico de los resultados se declara el
método analítico cromatográfico validado,
con su respectivo rango de aplicación de
acuerdo con lo estipulado en la legislación
vigente.
REFERENCIAS
1. Mastandrea, C., Chichizola, C., Ludueña,
B., Sánchez, H., Álvarez, H., Gutiérrez, A.
Hidrocarburos aromáticos policíclicos.
Riesgos para la salud y marcadores
biológicos. Acta Bioquímica Clínica
Latinoamericana. 2005; 39(1): 27-36.
2. Kromidas, S. Practical Problem Solving
in HPLC. Saarbrücken, Alemania: Wiley-
VCH. 2004
3. Abdel-Shafy, H.I., Mansour, S.M. A review
on polycyclic aromatic hydrocarbons:
Source, environ-mental impact, effect on
human health and remediation. Egyptian
Journal of Petroleum. 2015; 2-17. doi:
10.1016/j.ejpe.2015.03.011
4. 4 Bryer P. J., Elliott, J. N., y Willingham, E.
J. The effects of coal tar based pavement
sealer on amphib-ian development and
metamorphosis. Ecotoxicology.2006;
15(3): 241–247. doi: 10.1007/s10646-
005-0055-z
5. Santana-Romero, JL., Valdés-Callado,
M., Olivares-Rieumont, S., Lima-Cazorla,
L. Determinación de hidrocarburos
aromáticos policíclicos ligeros en aguas
superficiales de los ríos Almendares y
Luyanó en La Habana. Revista CENIC.
Ciencias Químicas. 2012; 43:1-7
6. Patiño Y., Díaz E. y Ordóñez S. Water
Micropol-lutants: Classification And
Treatment Technologies. Avances en
Ciencias e Ingeniería. 2014; 5: 1–20.
7. Blanco Enríquez, E. G., Zavala Díaz de
la Serna, F. J., Peralta Pérez, M. del
R., Ballinas Casarrubias, L., & Rocha
Gutiérrez, B. A. Análisis de la biorremoción
de hidrocarburos aromáticos policíclicos
en agua por SPME-GC/MS. Revista Int.
de Contaminación Ambiental. 2019;
35: 27–36. https://doi.org/10.20937/
RICA.2019.35.esp03.04
8. Mumtaz, M., & George, J. Toxicological
Profile for Polycyclic Aromatic
Hydrocarbons, U.S. Journal of Toxicology:
Cutaneous and Ocular Toxicology.
1999; 18(2): 141–147. https://doi.
org/10.3109/15569529909037564
9. Velásquez, V. Estandarización, Validación
y Evaluación de la Concentración de
Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos
en Aguas del Río Cuyabeno. Trabajo de
Grado. [Sangolquí, Ecuador]: Universidad
de las Fuerzas Armadas. 2014
10. Eurachem/Citac. Cuantificación de la
Incertidumbre en Medidas Analíticas,
Guía CG 4 EURACHEM / CITAC. In
Eurachem/Citac: Vol. 3rd Edition. 2012
11. Díaz Moroles, NE., Alfaro Barbosa, JM.,
Garza Ulloa, H. Método analítico para
detectar hidrocarburos aromáticos
policíclicos en agua potable. Ciencia
UANL. 2001; 4 (4): 420-425.
12. ISO (2017). ISO/ IEC 17025:2017
Requisitos generales para la competencia
de los laboratorios de ensayo y
calibración. International Organization
for Standardization.
28 │
Volumen. 5, Nº 9, diciembre 2021 - mayo 2022, pp. 22-28
Vargas et al. Validación de un método analíco que determina HAP’s en agua.
13. LabTraining (2011). High Performance
Liquid Chromatography (HPLC): Module
3. HPLC Free E – Course, (2011 – 2012),
Lab-Training.com. Recuperado de http://
lab-training.com/landing/free-hplc-
training-programme-5/
